Procedure bloedonderzoek NFI – alcohol in het verkeer

Voor wie interesse heeft in de precieze wijze waarop het alcoholgehalte in het bloed wordt vastgesteld tijdens een bloedonderzoek door het NFI, volgt hieronder de procedurele beschrijving die is vastgelegd in de bijlage I bij de Regeling bloed- en urineonderzoek.

__________________________________________________________________________________________

 

1.  De standaardoplossingen van alcohol in water

1.1.  Chemicaliën

Alcohol2.

1.2.  Apparatuur

Pipetten en maatkolven welke voldoen aan NEN 1753 en NEN 1750.

1.3.  Bereiding van oplossingen

Alcohol wordt verdund met vers uitgekookt en weer bekoeld water tot ongeveer 40 gewichtsprocenten. De relatieve dichtheid van deze oplossing, bij 20°C betrokken op water van 20°C, wordt met behulp van een pyknometer in vijfvoud bepaald. Het is toegestaan om een andere methodiek te gebruiken mits deze even nauwkeurig is als de pyknometrische. Uit het gemiddelde van deze gevonden waarden wordt het alcoholgehalte in vier cijfers gevonden met behulp van een alcoholtabel volgens Osborne3.

Ongeveer 60 gram van deze oplossing wordt nauwkeurig afgewogen en overgebracht in een maatkolf van 500 ml. De maatkolf wordt aangevuld tot 500 ml met vers uitgekookt en weer bekoeld water. Uit de op deze wijze verkregen oplossing worden, door afpipetteren onder gebruikmaking van 10, 20, 25 en 50 ml pipetten en maatkolven van 500 en 1.000 ml, ten minste drie alcohol-standaardoplossingen bereid met nauwkeurig bekende gehaltes. Deze gehaltes bedragen ongeveer4 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 of 3 mg alcohol per ml oplossing. De maatkolven worden aangevuld met uitgekookt en weer bekoeld water, waaraan per liter 10 gram natriumfluoride wordt toegevoegd.

De standaarden moeten in geheel gevuld en goed afgesloten vaatwerk van glas bij ± 4°C bewaard worden, dan wel in ampullen worden overgebracht, die na dichtsmelten bij kamertemperatuur kunnen worden bewaard. De standaarden mogen eerst gebruikt worden als zij dezelfde (kamer)temperatuur hebben aangenomen als de bloedmonsters. Na opening mogen deze standaarden niet langer dan één dag worden gebruikt.

2.  Enzymatische alcoholbepaling in bloed volgens de ADH-methode

Literatuur: D. Eskes, Blutalkohol, 6, 362 (1969).

2.1.  Principe

De alcohol uit het monster laat men, in een gesloten vat via de dampfase, diffunderen in een reactiemengsel. Hierin wordt de alcohol, in zwak alkalisch milieu, door nicotine-amideadeninendinucleotide (NAD) met behulp van alcoholdehydrogenase (ADH) als katalisator, tot acetaldehyde geoxy-deerd, volgens de reactievergelijking:

C2H5OH + NAD =C2H40 + NADH + H+

Het bij deze reactie gevormde acetaldehyde wordt met behulp van semicarbazide weggenomen.

De hoeveelheid gevormd NADH is equivalent met de oorspronkelijk aanwezige hoeveelheid alcohol en kan fotometrisch bepaald worden bij de golflengte van maximale extinctie gelegen bij ongeveer 340 nm.

2.2.  Reagentia

  • 1. Gedestilleerd- of gedemineraliseerd water, dat vrij is van stoffen, welke de reactie kunnen storen;
  • 2. Tetranatriumdifosfaat-decahydraat, semicarbazidehydrochloride, glycine, natriumhydroxide, ADH en NAD, alle pro-analysekwaliteit en vrij van stoffen die de bepaling kunnen storen;
  • 3. Blutalkohol U.V.-Test van Boehringer, of een andere daaraan gelijk-waardige combinatie van reagentia.

2.3.  Apparatuur

  • 1. Apparatuur voor het verdunnen en overbrengen van bloed, urine en waterige alcoholoplossingen (diluter);
  • 2. Reactievaatjes in de vorm van cylindertjes van zachte polypropyleen met inwendig holle deksel (als bijvoorbeeld Kartell 733/4) of Erlenme-ijer kolfjes met ingeslepen stop en ingesmolten glazen schaaltjes (zie tekeningen afgedrukt in de Staatscourant van 11 april 1978, nr. 70, bladzijde 7);
  • 3. Schijfjes van absorberend materiaal;
  • 4. Doseerpipet of dispenser voor het inbrengen van het reactiemengsel in de kolfjes of de reactievaatjes;
  • 5. Pipet van 50µl (met bijbehorende wegwerppunten) voor het afpipetteren van het verdunde bloedmonster;
  • 6. Spectrofotometer.

2.4.  Werkwijze 1 (zonder vóórverdunningsstap)

2.4.1.  Voorbereiding

De kolfjes of de reactievaatjes dienen schoon en droog te zijn. In de holle deksel van ieder polypropyleen cylindertje of in het glazen schaaltje van ieder kolfje wordt een schijfje absorberend materiaal gebracht. Het reactiemengsel wordt bereid door toevoeging van 390 mg NAD en 100 mg ADH aan 1 liter waterige oplossing waarin 30 gram tetranatriumdifosfaat-decahydraat, 7,5 gram semicarbazidehydrochloride en 1,5 gram glycine is opgelost en die met natronloog op een pH van 8,7 is gebracht dan wel volgens een ander beproefd voorschrift. Het bloedmonster wordt in het ontvangen monsterbuisje goed gehomogeniseerd.

2.4.2.  Uitvoering van de bepaling

Met de doseerpipet of dispenser worden de kolfjes of de reactievaatjes voorzien van ongeveer 2 ml reactiemengsel, nauwkeurig gemeten5. Tegelijk wordt 5 µl bloed, nauwkeurig gemeten, op het schijfje absorberend materiaal overgebracht met ongeveer 90 µl water door middel van een diluter. Onmiddellijk wordt het kolfje of het reactievaatje gesloten. Vervolgens worden deze weggezet bij een temperatuur tussen 22°C en 37°C totdat de reactie kwantitatief is verlopen (circa 1,5 tot 3 uur).

Nadat de reactie heeft plaatsgevonden wordt van het reactiemengsel de extinctie gemeten bij 340 nm. Deze meting mag slechts worden uitgevoerd als er geen condens in de kolfjes of de reactievaatjes aanwezig is.

Ter ijking wordt de bepaling per dag per analist met drie verschillende alcoholstandaardoplossingen van bekend gehalte in, tenminste, drievoud op identieke wijze uitgevoerd. Deze alcoholstandaarden worden qua volgorde goed gespreid over de monsterreeks en zijn voorts qua gehalte aangepast aan de te verwachten bloedalcoholgehaltes6 Per twintig enkelvoudige bepalingen of minder wordt ten minste één blanco-oplossing in de reeks opgenomen.

2.4.3.  Meting van de extincties

De spectrofotometer wordt met water op nul ingesteld, waarna de extinctie van de blanco’s, de standaarden en monsters kan worden gemeten. Het extinctieverschil tussen blanco en water mag voor een weglengte van 1 cm en de gebruikte golflengte niet meer dan 0,1 bedragen. De golflengteschaal en de lineariteit van de fotometrische schaal van de gebruikte spectrofotometer dienen regelmatig te worden gecontroleerd.

2.4.4.  Berekening van het alcoholgehalte

Uit de metingen aan de verschillende standaarden wordt van het gehalte (Ps) en de daarbij gevonden extinctie, verminderd met de extinctie van de in de reeks meest nabij gelegen blanco, (Es) het quotiënt (q) berekend:

253013

De waarden van q behorende bij één standaard worden gemiddeld

253014

. Vervolgens wordt het gemiddelde van de drie gevonden

253015

waarden berekend

253016

De spreidingsbreedte (w) van de waarden

253017

,

253018

en

253019

moet voldoen aan:

253020

Is aan deze voorwaarde niet voldaan dan wordt de ijking verworpen.

Uit de gevonden waarde van

253021

en de gemeten extinctie van het monster, verminderd met de extinctie van de blanco, (Ex) wordt het gezochte alcoholgehalte (Px) als volgt berekend:

253022

Voor het aantal bepalingen per monster en de toe te passen correctie op de uitkomst, zie bijlage 2.

2.5.  Werkwijze II (met voorverdunningsstap)

De bepaling kan worden uitgevoerd door het bloed vooraf te verdunnen. Hiertoe wordt 50 µl bloed, nauwkeurig gemeten, uit het monsterbuisje genomen en met water verdund met een constante factor gelegen tussen 1 tot 10 en 1 tot 15. Met behulp van een doseerpipet wordt 50 µl van dit verdunde bloed, nauwkeurig gemeten, overgebracht op het schijfje absorberend materiaal. De werkwijze is voorts gelijk als beschreven onder 2.4.

3.  Gaschromatografische alcoholbepaling in bloed 1

Literatuur: G. Machata, Blutalkohol 4, 252 (1967).

Onder 3.4 en 3.5 worden twee werkwijzen beschreven. Eén van deze werkwijzen moet worden gevolgd bij de gaschromatografische alcoholbepaling.

3.1.  Principe

Het bloed wordt nauwkeurig verdund in een vaste verhouding van ongeveer 1 op 10 met water waaraan 1-propanol is toegevoegd. Alcohol en 1-propanol worden gaschromatografisch gescheiden. Het bloedalcoholgehalte wordt berekend op basis van de piekoppervlakken of piekhoogten waarbij 1-propanol als interne standaard dient. Piekhoogten mogen uitsluitend worden gebruikt voor de berekening indien de symmetriefactor tussen 0,95 en 1.05 ligt. In plaats van 1-propanol is het gebruik van een andere, geschikte verbinding als interne standaard toegestaan.

3.2.  Reagentia

  • 1. Gedestilleerd- of gedemineraliseerd water, dat vrij is van stoffen, welke de reactie kunnen storen,
  • 2. Een waterige oplossing van 1-propanol (concentratie tussen 0,1 en 0,2 mg/ml), die geen stoffen bevat die de bepaling kunnen storen.

3.3.  Apparatuur

  • 1. Apparatuur voor het verdunnen en overbrengen van bloed, urine en waterige alcoholoplossingen (diluter);
  • 2. Gaschromatograaf uitgerust met een vlamionisatiedetector;
  • 3. Injectiespuit ten behoeve van de monsterintroductie in de gaschromatograaf;
  • 4. Recorder en integrator.

3.4.  Werkwijze A

3.4.1.  Voorbereiding

Het bloedmonster wordt in het ontvangen monsterbuisje goed gehomogeniseerd.

3.4.2.  Uitvoering van de bepaling

Er wordt een hoeveelheid bloed uit het monsterbuisje door middel van een diluter met een waterige 1-propanoloplossing in een constante verhouding van ongeveer 1 op 10 verdund. Van de aldus verkregen oplossing wordt een hoeveelheid van 0,5 à 5 µl in de gaschromatograaf gespoten. De kolom en de overige omstandigheden moeten zodanig worden gekozen dat alcohol en 1-propanol volledig worden gescheiden (resolutie ten minste 1,1). Ter ijking wordt per dag en per analist met drie verschillende alcoholstandaarden van bekend gehalte op identieke wijze de bepaling in, tenminste, drievoud uitgevoerd. Deze alcoholstandaarden worden qua volgorde goed gespreid over de monsterreeks en zijn voorts qua gehalte aangepast aan de te verwachten bloedalcoholgehaltes7.

3.4.3.  Berekening

De ijkfactor (y) wordt berekend uit het bekende gehalte Ps van de alcoholstandaard en de gemeten piekoppervlakken in het chromatogram van alcohol en 1-propanol volgens de formule:

253023

De waarden van y behorende bij één standaard worden gemiddeld

253024

. Vervolgens wordt het gemiddelde van de drie gevonden

253025

-waarden berekend

253026

.

De spreidingsbreedte (w) van de waarden

253027

,

253028

en

253029

moet voldoen aan:

253030

Is aan deze voorwaarde niet voldaan dan wordt de ijking verworpen. Het gemiddelde

253031

wordt elke dag opnieuw bepaald. Uit de gemeten piekoppervlakken in het chromatogram van alcohol en 1-propanol én de gevonden waarde van

253032

wordt het alcoholgehalte (Px) van het bloedmonster als volgt berekend:

253033

De berekening mag ook worden uitgevoerd op basis van piekhoogten onder de voorwaarde geformuleerd in 3.1. Voor het aantal bepalingen per monster en de toe te passen correctie op de uitkomst, zie bijlage 2.

3.5.  Werkwijze B

3.5.1.  Voorbereiding

Het bloedmonster wordt in het ontvangen monsterbuisje goed gehomogeniseerd.

3.5.2.  Uitvoering van de bepaling

Er wordt een hoeveelheid bloed uit het monsterbuisje door middel van een diluter met een waterige interne standaardoplossing in een constante verhouding van ongeveer 1 op 10 verdund. Van de aldus verkregen oplossing wordt een hoeveelheid van 0,5 à 5 μl in de gaschromatograaf gespoten. De kolom en de overige omstandigheden moeten zodanig worden gekozen dat alcohol en de interne standaard volledig worden gescheiden (resolutie ten minste 1,1). Ter ijking worden ten minste 6 alcoholstandaarden van bekend gehalte op identieke wijze gemeten. Deze alcoholstandaarden liggen qua gehalte verspreid over de te verwachten bloedalcoholgehaltes.

3.5.3.  Berekening

Berekeningen worden uitgevoerd op basis van piekoppervlakken. De berekening mag ook worden uitgevoerd op basis van piekhoogten indien de symmetriefactor tussen 0,95 en 1,05 ligt.

De concentratie in een monster wordt berekend aan de hand van een ijklijn, waarin is uitgezet het relatieve piekoppervlak (relatief ten opzichte van het oppervlak van de interne standaard) versus de ethanolconcentratie. De beste fit van de ijklijn wordt berekend met lineaire regressie.

4.  Gaschromatografische alcoholbepaling in bloed II

Literatuur: D. S. Christmore et al; J. For. Sci. 29, 1038 (1984).

Het is toegestaan de gaschromatografische alcoholbepaling in bloed uit te voeren volgens het zogenaamde principe van head-space-chromatografie. Er moet dan rekening worden gehouden met optredende matrix-effecten, zodat de nauwkeurigheid van de bepaling niet wordt aangetast. De werkwijze is voorts analoog als beschreven onder 3. Bij head-space-chromatografie wordt een groter volume geïnjecteerd dan beschreven onder 3.

5.  De alcoholbepaling in urine

5.1.  Werkwijze

Voor de bepaling van het alcoholgehalte in urinemonsters kunnen de in deze bijlage onder 2, 3 en 4 beschreven bepalingsmethoden voor bloed ongewijzigd worden toegepast.

5.2.  Berekening van het alcoholgehalte van het bloed uit het urine-alcoholgehalte

De urine-alcoholgehaltes worden gemiddeld en gecorrigeerd. Voor het aantal bepalingen per monster en de toe te passen correctie op de uit komst, zie bijlage 2. Bedraagt het zo verkregen urine-alcoholgehalte (u.a.g.) 1,00 mg/ml of meer dan kunnen een onderste en een bovenste grens van het bloedalcoholgehalte (b.a.g.) daaruit als volgt worden berekend.

Onderste grens b.a.g. =

253034

Bovenste grens b.a.g. =

253035

De kans dat het werkelijke bloedalcoholgehalte nog lager respectievelijk hoger ligt, dan de aldus berekende bloedalcoholgehaltes is voor beide gevallen 1%. Deze berekeningen worden niet uitgevoerd bij een u.a.g. welke kleiner is dan 1,00 mg/ml.

Direct contact met een advocaat?
Meld gratis en vrijblijvend uw zaak aan.
Zaak aanmelden